008240612s2023      us  |||||||||||||||c||eng  d
■001000016933904
■00520240214101504
■006m          o    d                
■007cr#unu||||||||
■020    ▼a9798380317696
■035    ▼a(MiAaPQ)AAI30567220
■040    ▼aMiAaPQ▼cMiAaPQ
■0820  ▼a574.191
■1001  ▼aXu,  Yasu.▼0(orcid)0000-0001-8606-8150
■24510▼aEngineering  CRISPR-Based  Toggle  Switches  in  Escherichia  coli▼h[electronic  resource]
■260    ▼a[S.l.]:▼bCornell  University.  ▼c2023
■260  1▼aAnn  Arbor  :▼bProQuest  Dissertations  &  Theses,  ▼c2023
■300    ▼a1  online  resource(198  p.)
■500    ▼aSource:  Dissertations  Abstracts  International,  Volume:  85-03,  Section:  B.
■500    ▼aAdvisor:  Lambert,  Guillaume.
■5021  ▼aThesis  (Ph.D.)--Cornell  University,  2023.
■506    ▼aThis  item  must  not  be  sold  to  any  third  party  vendors.
■520    ▼aIn  the  field  of  synthetic  biology,  genetic  engineering  techniques  are  used  to  create  modular  components  and  novel  biological  interactions  within  microorganisms.  One  example  of  this  is  the  development  of  toggle  switches,  which  are  bistable  genetic  circuits  that  can  store  1  bit  of  information  in  living  organisms  like  E.  coli  bacteria.  However,  existing  toggle  switches  based  on  promoter-repressor  pairs,  such  as  LacI  and  TetR,  have  limitations  in  terms  of  orthogonality  and  programmability.  Recent  advancements  in  synthetic  biology  have  demonstrated  the  potential  of  using  catalytically  inactive  versions  of  Cas  proteins,  known  as  dCas,  to  create  logic  switches.  These  dCas  proteins  can  selectively  bind  to  specific  DNA  sequences  and  offer  an  alternative  approach  for  constructing  functional  toggle  switches,  addressing  the  limitations  of  traditional  designs.  In  this  study,  we  aim  to  utilize  the  CRISPRi-dCas12a  system  as  the  foundation  for  our  genetic  toggle  switch.  To  begin,  we  develop  a  thermodynamic  model  to  explore  the  factors  influencing  the  repression  efficiency  of  CRISPRi-dCas12a.  We  assume  that  the  fully  assembled  dCas12a-crRNA  complex  functions  similarly  to  the  simple  repression  motif  regulatory  architecture  when  targeting  the  promoter  region,  creating  a  basic  genetic  NOT  gate.  Our  model  reveals  that  the  competition  between  RNAP  and  the  dCas12a  complex  for  binding  to  the  same  promoter,  as  well  as  the  availability  and  affinity  of  target  sites  and  potential  competitor  sites,  all  contribute  to  the  strength  of  promoter  occupancy  competition.  To  experimentally  investigate  the  concealed  thermodynamic  factors  affecting  Cas12a  DNA  binding,  we  employ  a  high-throughput  assay  called  XSeq.  This  assay  allows  us  to  examine  various  parameters,  including  the  impact  of  protospacer  adjacent  motif  sequences,  the  type  and  location  of  guide-target  mismatches,  and  their  influence  on  Cas12a  DNA  binding.  Next,  we  construct  our  CRISPRi  toggle  switch  by  interconnecting  two  of  the  aforementioned  NOT  gates  in  a  mutually  inhibitory  network.  To  understand  the  bistability  of  CRISPRi  toggle  switches  at  the  steady  state,  we  develop  a  thermodynamic  model  that  considers  parameters  such  as  target  sequence  affinity,  crRNA  properties,  net  production  activity  of  the  dCas12a  complex,  and  the  copy  number  of  the  toggle  switch.  We  then  leverage  the  XSeq  assay  to  efficiently  characterize  these  parameters  for  numerous  toggle  switch  constructs.  Furthermore,  to  visualize  the  kinetics  of  our  CRISPR-based  toggle  switch  designs,  we  introduce  a  second  controller  plasmid  to  set  and  reset  the  switch  state.  By  combining  single-cell  imaging  techniques  with  a  microfluidic  chip  platform,  we  can  observe  the  real-time  actuation  dynamics  of  the  toggle  switch.  Our  results  uncover  different  classes  of  switching  activities  and  memory  retention  abilities,  demonstrating  how  manipulating  the  growth  conditions  of  the  bacteria  through  different  media  types  can  influence  the  behavior  of  the  toggle  switch.
■590    ▼aSchool  code:  0058.
■650  4▼aBiophysics.
■650  4▼aSystematic  biology.
■650  4▼aGenetics.
■653    ▼aCRISPR-dFnCas12a
■653    ▼aCRISPRi
■653    ▼aGenetic  circuits
■653    ▼aToggle  switch
■653    ▼aTunable  plasmid  copy  number
■690    ▼a0786
■690    ▼a0423
■690    ▼a0369
■71020▼aCornell  University▼bBiophysics.
■7730  ▼tDissertations  Abstracts  International▼g85-03B.
■773    ▼tDissertation  Abstract  International
■790    ▼a0058
■791    ▼aPh.D.
■792    ▼a2023
■793    ▼aEnglish
■85640▼uhttp://www.riss.kr/pdu/ddodLink.do?id=T16933904▼nKERIS▼z이  자료의  원문은  한국교육학술정보원에서  제공합니다.
■980    ▼a202402▼f2024