MARC

 008250123s2024        us                              c    eng  d
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■020    ▼a9798382776392
■035    ▼a(MiAaPQ)AAI31295895
■040    ▼aMiAaPQ▼cMiAaPQ
■0820  ▼a540
■1001  ▼aBrooks,  Frederick  Phillips,  III.▼0(orcid)0000-0002-4334-8192
■24510▼aMethods  and  Tool  Development  for  Robust  Biological  Voltage  Imaging
■260    ▼a[Sl]▼bHarvard  University▼c2024
■260  1▼aAnn  Arbor▼bProQuest  Dissertations  &  Theses▼c2024
■300    ▼a147  p
■500    ▼aSource:  Dissertations  Abstracts  International,  Volume:  85-12,  Section:  B.
■500    ▼aAdvisor:  Cohen,  Adam  E.
■5021  ▼aThesis  (Ph.D.)--Harvard  University,  2024.
■520    ▼aElectrical  potential  differences  across  membranes  play  important  roles  throughout  biology,  particularly  in  the  brain,  where  propagating  electrical  waves  called  action  potentials  and  smaller  subthreshold  perturbations  carry  information  within  neurons.  These  electrical  signals  can  be  measured  at  tissue-scale  resolution  by  external  electrodes  or  at  a  higher  resolution  by  electrodes  inserted  into  the  brain.  For  the  highest  resolution  measurements  that  avoid  many  of  the  problems  associated  with  electrode  insertion  into  the  brain,  the  use  of  dyes  or  proteins  that  transduce  the  electrical  signal  into  an  optical  readout  is  a  rapidly  maturing  technique.  While  voltage  imaging  has  already  enabled  significant  scientific  advances,  I  address  in  this  dissertation  several  barriers  that  have  stood  in  the  way  of  broader  use  of  voltage  imaging.First,  I  worked  to  overcome  the  loss  of  voltage  sensitivity  under  two-photon  imaging  conditions  hitherto  seen  in  microbial  rhodopsin  voltage  indicators.  This  class  of  genetically  encoded  voltage  indicators  (GEVIs)  provides  superior  response  kinetics  under  one-photon  conditions  but  loses  sensitivity  under  two-photon  conditions.  I  experimentally  characterized  the  photocycle  of  the  Forster  resonance  energy  transfer  (FRET)-opsin  GEVIs,  Voltron1  and  Voltron2,  and  used  the  results  of  these  experiments  to  rationally  design  two-photon  imaging  conditions  that  restored  voltage  sensitivity.  I  demonstrated  this  technique  for  two-photon  voltage  imaging  with  Voltron2  in  barrel  cortex  of  a  live  mouse.  These  results  open  the  door  to  high-speed  two-photon  voltage  imaging  of  FRET-opsin  GEVIs  in  vivo  and  provide  insight  into  the  reporters'  photocycle  that  is  useful  both  for  robust  onephoton  imaging  and  for  future  development  of  two-photon-optimized  rhodopsin-based  GEVIs.Second,  I  bring  together  experimental  and  theoretical  work  to  provide  a  set  of  well-characterized  upper  bounds  to  two-photon  voltage  imaging  performance  in  vivo.  While  aspects  of  this  have  previously  been  addressed,  there  has  not  been  a  single  work  addressing  these  various  limits  with  a  specific  focus  on  two-photon  voltage  imaging.  As  voltage  imaging  operates  under  different  constraints  than  other  more  familiar  types  of  functional  imaging,  this  treatment  is  necessary  to  set  realistic  expectations,  delineate  the  most  productive  avenues  for  optimization,  and  provide  a  common  theoretical  groundwork  for  comparing  voltage  imaging  performance.  Among  other  conclusions,  we  found  that  current  technologies  are  limited  to  high  quality  imaging  of  12  neurons  under  standard  conditions  at  depths  greater  than  300μm  in  vivo.Third,  I  present  Luminos,  an  open-source  MATLAB-based  software  package  for  highly  synchronized  control  of  high-speed  microscopes.  The  distinct  constraints  of  voltage  imaging  place  distinct  constraints  on  the  required  instrumentation.  Existing  general-purpose  control  libraries  are  inadequate  for  the  speed  and  synchronization  required  for  voltage  imaging  experiments  involving  complex  electrical  and  optical  stimulation  and  recording.  Rather  than  produce  control  code  narrowly-tailored  to  a  specific  microscope  or  experiment,  our  lab  embarked  on  a  project  to  develop  a  modular  customizable  control  suite  that  is  now  used  for  data  acquisition  on  all  of  the  seven  custom  microscopes  in  our  lab  and  has  been  publicly  released  with  the  aim  of  making  voltage  imaging  instrumentation  more  accessible  to  the  broader  field.Fourth,  I  performed  a  theoretical  and  experimental  treatment  of  the  calibration  of  intensity-based  voltage  indicators  to  an  absolute  voltage  scale.  Because  of  unknown  expression  levels,  background,  optical  efficiency,  and  other  factors,  intensity-based  imaging  of  a  single  reporter  provides  only  relative  signals  that  cannot  be  calibrated  either  to  an  external  scale  or  across  significant  spatial  or  temporal  extent.  I  mathematically  and  experimentally  analyzed  the  feasibility  of  calibrating  voltage  responses  with  a  second  independently  expressed  voltage  indicator  and  found  that  a  combination  of  a  linear  indicator  with  a  nonlinear  indicator  tailored  to  the  voltage  range  of  interest  can  provide  a  resilient  calibration  to  an  absolute  scale.  Likely  due  to  a  publication  bias  towards  reporting  more  linear  indicators,  high-performance  nonlinear  indicators  are  not  currently  available,  but  this  theoretical  treatment  motivates  their  development  and  dissemination.Finally,  I  discuss  the  technical  outlook  for  voltage  imaging  in  light  of  this  work.  By  characterizing  the  performance  limits  of  two-photon  voltage  imaging,  uncovering  the  mechanism  of  two-photon  voltage  insensitivity  in  opsin-GEVIs,  and  proposing  a  method  for  dual  indicator  absolute  voltage  imaging,  I  provide  insight  into  the  most  productive  directions  for  future  voltage  indicator  development.  Both  the  demonstration  of  two-photon  voltage  imaging  with  Voltron2  and  the  release  of  the  Luminos  software  are  important  steps  towards  making  voltage  imaging  more  broadly  useful  and  accessible.  Important  work  remains  in  further  optimizing  opsin-GEVIs  for  two-photon  imaging  and  in  making  voltage  imaging  hardware  more  accessible.
■590    ▼aSchool  code:  0084.
■650  4▼aChemistry
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■690    ▼a0219
■71020▼aHarvard  University▼bChemistry  and  Chemical  Biology.
■7730  ▼tDissertations  Abstracts  International▼g85-12B.
■790    ▼a0084
■791    ▼aPh.D.
■792    ▼a2024
■793    ▼aEnglish
■85640▼uhttp://www.riss.kr/pdu/ddodLink.do?id=T17161745▼nKERIS▼z이  자료의  원문은  한국교육학술정보원에서  제공합니다.

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