MARC

 008250123s2024        us                              c    eng  d
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■020    ▼a9798382405254
■035    ▼a(MiAaPQ)AAI31243668
■040    ▼aMiAaPQ▼cMiAaPQ
■0820  ▼a660
■1001  ▼aTynan,  Kyle  J.▼0(orcid)0009-0002-2255-3637
■24510▼aRapid  Quality  Analysis  of  mRNA  Lipid  Nanoparticles  Using  Micelle  Formulations
■260    ▼a[Sl]▼bCarnegie  Mellon  University▼c2024
■260  1▼aAnn  Arbor▼bProQuest  Dissertations  &  Theses▼c2024
■300    ▼a165  p
■500    ▼aSource:  Dissertations  Abstracts  International,  Volume:  85-11,  Section:  B.
■500    ▼aAdvisor:  Schneider,  James  W.
■5021  ▼aThesis  (Ph.D.)--Carnegie  Mellon  University,  2024.
■520    ▼aPharmaceutical  manufacturers  developed  mRNA  lipid  nanoparticle  (LNP)  vaccines  as  an  effective  method  to  combat  COVID-19.  With  multiple  COVID-19  variants  already  in  circulation,  the  requirement  of  booster  vaccines  every  several  months  to  maintain  immunity,  and  manufacturers'  new  focus  on  using  mRNA  LNP  vaccines  against  other  infectious  diseases,  the  high  demand  for  mRNA  LNP  vaccines  will  only  increase.  This  necessitates  a  high  throughput  method  of  rapidly  determining  vaccine  quality  to  ensure  the  correct  dosage  and  functionality  is  maintained  in  each  vaccine.  The  critical  quality  attributes  (CQA)  for  mRNA  LNP  vaccines  are:  mRNA  length  (a  measure  of  the  identity  of  mRNA),  mRNA  titer,  and  LNP  degradation  (to  ensure  LNPs  have  properly  encapsulated  the  mRNA).  All  of  these  CQAs  can  be  determined  with  a  micelle  formulation  method. Using  micelle  capillary  electrophoresis,  we  developed  an  electrophoretic  technique  where  instead  of  a  sieve-like  gel  we  use  an  entangled  micelle  network  to  perform  length-based  separations.  We  aimed  to  use  this  technique  to  determine  length,  titer,  encapsulation  efficiency,  and  lipid  quality  (as  measured  by  the  release  kinetics  of  mRNA  from  the  lipid  shell  while  being  lysed  by  the  surfactant  during  electrophoresis).  However,  the  entangled  micelle  network  rapidly  lyses  the  mRNA  LNP,  thus  it  is  impossible  to  measure  the  release  of  mRNA  while  also  achieving  a  length-based  separation.  Regardless,  when  using  micelle  capillary  electrophoresis,  we  can  determine  the  identity  and  titer  of  mRNA  LNPs.  Furthermore,  we  are  capable  of  assessing  degradation  effects  on  mRNA  LNPs  to  due  temperature,  freeze/thaw  cycles,  and  enzymatic  digestion.  We  discovered  that  lyophilization  with  the  use  of  a  cryoprotectant  prior  to  long  term  high  temperature  storage  is  protective  of  mRNA.  Without  lyophilization,  the  mRNA  LNPs  degrade  rapidly  at  room  temperature.  Even  mRNA  stored  for  3  months  at  37°C  remains  intact  if  previously  lyophilized.  Freeze/thaw  cycling  is  not  as  damaging  mRNAs  as  room  temperature  storage,  and  enzymes  are  capable  of  permeating  the  LNP  membrane  and  degrading  mRNA.To  overcome  the  limitation  of  micelle  capillary  electrophoresis,  we  developed  another  analytical  technique  using  stopped-flow  kinetics  and  spectrometry.  The  assay  uses  a  stained  mRNA  LNP  sample  and  mixes  it  with  a  low  surfactant  buffer.  The  lysing  process  is  tracked  using  spectrometry  and  with  it  we  can  determine  the  encapsulation  efficiency  of  the  mRNA  LNP  and  the  release  kinetics  of  the  mRNA  from  the  lipid  shell.  We  determine  that  manufacturing  conditions  and  lipid  concentrations  do  not  have  a  significant  impact  on  the  release  kinetics  of  the  mRNA,  however  they  do  dramatically  affect  the  encapsulation  efficiency.  However,  the  PEGylated  lipid  content  dramatically  affects  the  release  kinetics,  with  less  PEGylated  lipid,  there  is  significantly  higher  release  time.  We  propose  that  the  PEG  causes  steric  hindrance  and  prevents  mRNA  LNP  aggregation,  thus  upon  removal  of  the  PEGylated  lipid,  the  mRNA  LNPs  aggregate  and  thus  require  more  time  to  be  fully  lysed.Furthermore,  we  have  developed  an  on-line  concentration  technique  called  reverse  isotachophoresis  with  micelles,  where  a  system  of  different  electrophoretic  mobility  buffers  is  used  to  concentrate  a  sample  and  then  a  separation  occurs.  An  application  of  which  is  for  adventitious  agent  detection  in  biological  processes,  such  as  determining  the  presence  of  mouse  hepatitis  virus  in  CHO  cells.  We  show  that  we  are  capable  of  achieving  femtomolar  level  detection  of  MHV  in  5  minutes  using  this  technique.  This  technique  relies  upon  electro-osmotic  flow  instead  of  electrophoretic  flow,  thus  in  order  to  achieve  1  fM  detection  with  a  high  viscosity  system,  the  time  allowed  to  concentrate  our  sample  must  be  adjusted.  To  do  this,  we  had  to  increase  the  length  of  our  capillary  and  increase  the  concentration  time.  To  maintain  a  5-minute  runtime,  we  reversed  the  flow  of  the  technique,  where  the  sample  is  concentrated  out  the  outlet  and  sent  back  towards  the  detector,  as  opposed  to  being  concentrated  at  the  inlet  and  allowing  it  to  migrate  towards  the  detector.  Effectively,  this  decreased  the  length  of  the  detector  from  90  cm  to  10  cm.  Finally,  the  alkane  tail  on  the  γPNA  probe  plays  an  important  role  in  increasing  the  LOD  by  causing  a  sweeping  effect  to  occur.  The  alkane  tail  causes  the  viral  DNA  to  concentrate  at  the  interface  between  the  micelle-free  and  micelle  zones,  thus  introducing  another  mechanism  to  increase  the  limit  of  detection.We  discussed  our  development  of  different  types  of  nucleic  acid  probes  to  bind  to  mRNA.  We  developed  PNA,  γPNA,  LNA,  and  DNA  probes.  We  had  the  most  success  with  binding  EPO  specific  PNA  or  γPNA,  however  we  would  still  observe  multiple  binding  peaks.  Future  work  should  be  focused  on  improving  probe  design  for  high  binding  affinity  and  reducing  the  number  of  multiple  peaks  present  in  the  electropherogram.
■590    ▼aSchool  code:  0041.
■650  4▼aChemical  engineering
■650  4▼aCellular  biology
■650  4▼aMolecular  biology
■650  4▼aNanoscience
■653    ▼aCapillary  electrophoresis
■653    ▼aMicelles
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■653    ▼amRNA  therapeutics
■653    ▼aCritical  quality  attributes
■690    ▼a0542
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■690    ▼a0379
■690    ▼a0307
■71020▼aCarnegie  Mellon  University▼bChemical  Engineering.
■7730  ▼tDissertations  Abstracts  International▼g85-11B.
■790    ▼a0041
■791    ▼aPh.D.
■792    ▼a2024
■793    ▼aEnglish
■85640▼uhttp://www.riss.kr/pdu/ddodLink.do?id=T17161429▼nKERIS▼z이  자료의  원문은  한국교육학술정보원에서  제공합니다.

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