MARC

 008250123s2024        us                              c    eng  d
■001000017163498
■00520250211152716
■006m          o    d                
■007cr#unu||||||||
■020    ▼a9798384063728
■035    ▼a(MiAaPQ)AAI31489076
■040    ▼aMiAaPQ▼cMiAaPQ
■0820  ▼a574
■1001  ▼aPeng,  Linghang  Steve.
■24510▼aI:  Antibody  and  Compound  Drug  Discovery  for  Pan-Coronavirus  II:  PLD3  and  PLD4:  A  Tale  of  Two  Exonucleases
■260    ▼a[Sl]▼bThe  Scripps  Research  Institute▼c2024
■260  1▼aAnn  Arbor▼bProQuest  Dissertations  &  Theses▼c2024
■300    ▼a232  p
■500    ▼aSource:  Dissertations  Abstracts  International,  Volume:  86-03,  Section:  B.
■500    ▼aAdvisor:  Nemazee,  David;Teijaro,  John  R.
■5021  ▼aThesis  (Ph.D.)--The  Scripps  Research  Institute,  2024.
■520    ▼aPart  I:  Antibody  and  Compound  Drug  Discovery  for  Pan-coronavirusCOVID-19  is  the  largest  recorded  pandemic  in  human  history.  The  pathogen  of  COVID-19,  SARS-CoV-2,  is  an  enveloped  ssRNA  virus  belonging  to  the  Coronaviridae  family.  Spike  is  the  major  glycoprotein  on  SARS-CoV-2  responsible  for  receptor  (ACE2)  binding  and  cell  entry,  and  also  the  target  for  neutralizing  antibodies.In  this  part  of  my  thesis,  we  first  set  up  several  assays  at  the  beginning  of  the  COVID-19  pandemic,  including  pseudotyped  virus  (PSV)  assay,  proximity-based  neutralization  (PBN)  assay,  SARS-CoV-2  live  virus  neutralization  protocols  and  cell-cell  fusion  assays.  PSV  assay  uses  lenti-  or  retroviral  backbones  and  coronavirus  spike  protein  to  produce  replication-incompetent  virions  that  mimic  authentic  spike-receptor  interaction  and  viral  entry  process.  PBN  assay  uses  split  luciferase  fused  to  spike  and  ACE2  to  measure  the  antibody  titer  blocking  spike-ACE2  interactions  in  vitro,  being  a  rapid,  cell-free  alternative  of  traditional  cell-based  neutralization  assay.  These  assays  have  greatly  accelerated  the  research  on  SARS-CoV-2.Then  we  applied  these  assays  to  specific  research  projects.  Using  the  PSV  assay,  we  initiated  a  high  throughput  compound  screening  for  SARS-CoV-2  viral  entry  inhibitors  in  collaboration  with  Scripps  Calibr.  Within  the  ReFRAME  library,  18  potent  coronavirus-specific  entry  inhibitors  were  identified  and  they  exhibited  (sub)micromolar  IC50  against  SARS-CoV-2  PSV  and  live  virus  in  vitro.  The  mechanisms  of  action  needed  further  investigation.Another  project  is  to  characterize  SARS-CoV-2  broadly  neutralizing  antibodies  (bnAb)  in  collaboration  with  NIH.  We  performed  neutralization  assays  to  characterize  pan-coronavirus  reactive  mAbs  and  identified  two  conserved  epitopes  on  spike-S2  domain:  fusion  peptide  (FP)  and  stem  helix  (SH)  region  for  SARS-CoV-2  bnAbs.  Selected  bnAbs,  including  COV44-79  (anti-FP)  and  COV89-22  (anti-SH),  protected  animals  from  SARS-CoV-2  and  MERS  infection.  Sequence  analysis  of  anti-SH  bnAbs  identified  a  dominant  heavy  and  light  chain  V  gene  combination  of  VH1-46  and  VK3-20,  which  may  instruct  future  germline-targeting  vaccine  design  for  pan-coronaviruses.Part  II:  PLD3  and  PLD4:  A  Tale  of  Two  ExonucleasesNucleic  acid  sensing  is  an  important  aspect  of  innate  immunity.  Endosomal  toll-like  receptors  TLR7/8/9  detect  the  presence  of  ssRNA  and  ssDNA  with  CpG  motifs,  respectively  and  activate  pro-inflammatory  pathways  such  as  NF-κB.  Phospholipase  D  family  members  PLD3  and  PLD4  are  two  endolysosomal  5'  exonucleases  that  digest  ssDNA  and  ssRNA  to  regulate  the  activation  of  multiple  nucleic  acid  sensors  including  TLR7/9  and  STING.  In  Pld3-/-Pld4-/-  mouse  model,  hemophagocytic  lymphohistiocytosis  (HLH)-like  symptoms  were  observed,  and  the  mice  died  of  severe  autoimmunity  one  month  after  birth.  PLD3  and  PLD4  have  been  genetically  associated  with  neuro-degenerative  disorders  and  autoimmune  diseases,  respectively.  However,  the  detailed  mechanism  is  unclear.Here,  we  conducted  biochemical  experiments  to  study  the  enzymology  of  PLD3  and  PLD4.  The  crystal  structures  of  mouse  PLD3  and  human  PLD4  ectodomain  were  determined.  PLD3  and  PLD4  form  homodimers,  and  within  each  molecule  domain  A  and  B  form  an  intra-chain  dimer,  with  a  basic  catalytic  site  at  the  interface.  Based  on  the  structure,  a  two-step  Ping-Pong  mechanism  of  catalysis  was  proposed.  In  addition,  by  capturing  a  pHis  intermediate  of  PLD3,  we  unexpectedly  discovered  the  5'  phosphatase  of  PLD3/4.  Fluorescence  resonance  energy  transfer  (FRET)  assay  and  reporter  cell  assay  were  established  to  measure  the  enzyme  activity  of  PLD3/4  in  vitro.  Mutagenesis  of  key  amino  acids  on  PLD3/4  revealed  structure-function  relationships.  We  also  investigated  the  biochemical  properties  of  several  disease-associated  mutants,  and  found  several  mutants  (hPLD3  I163M  and  L308P;  hPLD4:  R235Q  and  S283L)  have  reduced  enzymatic  activity  and  thermostability.Using  the  same  FRET  assay,  we  carried  out  a  high  throughput  screening  for  PLD3  and  PLD4  inhibitors.  Several  compounds  with  (sub)micromolar  IC50  values  have  been  identified,  and  we  confirmed  their  potency  in  vitro.  Since  PLD3  and  PLD4  inhibition  leads  to  nucleic  acid  sensor-driven  immune  activations,  we  propose  that  these  inhibitors  may  have  a  potential  value  in  cancer  immunotherapy  and  vaccine  adjuvant.
■590    ▼aSchool  code:  1179.
■650  4▼aBiology
■650  4▼aImmunology
■650  4▼aVirology
■653    ▼aBroadly  neutralizing  antibodies
■653    ▼aPLD3  inhibitors
■653    ▼aPLD4  inhibitors
■653    ▼aSARS-CoV-2
■653    ▼aResponsible  for  receptor
■690    ▼a0306
■690    ▼a0982
■690    ▼a0720
■71020▼aThe  Scripps  Research  Institute▼bImmunology.
■7730  ▼tDissertations  Abstracts  International▼g86-03B.
■790    ▼a1179
■791    ▼aPh.D.
■792    ▼a2024
■793    ▼aEnglish
■85640▼uhttp://www.riss.kr/pdu/ddodLink.do?id=T17163498▼nKERIS▼z이  자료의  원문은  한국교육학술정보원에서  제공합니다.

Preview

Export

ChatGPT Discussion

AI Recommended Related Books