MARC

 008260126s2025        us                              c    eng  d
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■020    ▼a9798297617704
■035    ▼a(MiAaPQ)AAI32244665
■040    ▼aMiAaPQ▼cMiAaPQ
■0820  ▼a574.191
■1001  ▼aKidane,  Aaron  Kahsay.
■24510▼aDiscerning  the  Influence  of  Cationic  and  Aromatic  Amino  Acid  Identity  on  Biomolecular  Condensates
■260    ▼a[Sl]▼bColumbia  University▼c2025
■260  1▼aAnn  Arbor▼bProQuest  Dissertations  &  Theses▼c2025
■300    ▼a197  p
■500    ▼aSource:  Dissertations  Abstracts  International,  Volume:  87-04,  Section:  B.
■500    ▼aAdvisor:  Obermeyer,  Allie  C.
■5021  ▼aThesis  (Ph.D.)--Columbia  University,  2025.
■520    ▼aThe  crowded  cellular  milieu  contains  a  dry  weight  of  up  to  90  percent  macromolecules,  with  proteins  making  up  20  to  30  percent  of  that  mass.  Through  billions  of  years  of  evolution,  eukaryotic  cells  have  developed  internal  membrane  bound  organelles  that  further  organize  the  crowded  cytosol,  and  separate  incompatible  reactions  and  processes.  This  high  level  of  organization  lends  itself  to  efficient  nutrient  uptake,  energy  production,  cell  to  cell  signaling,  protein  folding,  and  macromolecule  recycling.  Although  membrane-bound  organelles  have  been  widely  studied  since  the  mid  18th  century,  recent  discoveries  have  uncovered  the  role  of  biomolecular  condensates  (BMC),  also  known  as  membraneless  organelles  (MBO),  in  a  number  of  cellular  functions.BMCs  are  defined  by  a  dense  region  of  macromolecules  that  spontaneously  coalesce  within  cells.  One  of  the  chief  phenomena  that  regulates  condensate  formation  is  liquid-liquid  phase  separation  (LLPS),  in  which  macromolecules  will  spontaneously  demix  from  their  environment  and  form  highly  dynamic,  macromolecule-rich  liquid  droplets  that  are  energetically  separated  from  the  surrounding  dilute  phase.  The  role  of  BMCs  in  RNA  metabolism,  mechanical  and  thermal  stress  responses,  as  well  as  heterochromatin  packing  in  the  nucleus  has  been  widely  studied.  In  addition,  their  aberrant  role  in  a  number  of  prion-related  diseases  has  also  been  critically  reported  on.At  the  same  time,  our  understanding  of  the  molecular  interactions  underpinning  BMC  behavior  has  also  gained  a  large  degree  of  interest,  with  wide  ranging  advancements  in  our  ability  to  understand  and  predict  the  biomacromolecules  that  are  able  to  engage  with  and  form  BMCs.  Some  of  the  more  common  structural  motifs  that  are  found  to  promote  phase  separation  are  large  disordered  domains,  highly  charged  blocks  separated  by  uncharged  or  nonpolar  regions,  and  the  ability  to  complex  with  oppositely  charged  polymers;  primarily  RNA.  Nevertheless,  our  understanding  of  the  role  primary  amino  acid  content  confers  on  condensate  dynamics  remains  poorly  understood.In  this  dissertation,  I  aim  to  uncover  the  specific  role  of  aromatic  and  cationic  side  chain  composition  on  BMC  characteristics.  To  achieve  these  goals,  I  use  in  vitro  assays  composed  of  purified  protein  and  RNA,  as  well  as  a  BL21  strain  of  E.  coli  (NiCo21)  as  a  model  organism  to  study  the  impact  of  sequence-level  cationic  protein  variants  in  a  simple  living  system.  I  also  created  a  panel  of  four  engineered  charge  variant  proteins  (GFP(0)  and  GFP(+6))  derived  from  superfolder  green  fluorescent  protein  (sfGFP)  with  poly-lysine  or  poly-arginine  tags  appended  to  the  C-terminus.I  first  investigated  discrepancies  within  the  phase  boundary  of  the  engineered  proteins  in  complex  with  RNA  due  to  the  charge  and  sequence  variations.  I  next  uncovered  the  impact  of  non-covalent  interactions  on  these  condensates,  using  NaCl,  1,6-hexanediol,  and  urea  to  understand  the  role  of  simple  electrostatics,  hydrophobic  interactions,  and  hydrogen  bonding,  respectively.  These  studies  revealed  that  although  there  are  minimal  changes  in  the  initial  phase  boundary  between  arginine  and  lysine-based  variants,  there  are  significant  increases  to  electrostatic  interaction  strength  that  is  attributable  to  the  change  in  amino  acid  composition.  Hydrophobics  played  no  role  in  the  behavior  of  these  engineered  condensates  and  hydrogen  bonding  played  an  equivalent  role  across  all  constructs.  I  also  found  that  the  in  vitro  results  were  quantifiable  and  replicated  in  the  E.  coli  experiments.  I  found  that  there  was  a  higher  ratio  of  protein  in  the  condensate  compared  to  the  cytoplasm  in  GFP(+6)  and  arginine  tagged  variants  compared  to  GFP(0)  and  lysine  tagged  variants.  In  addition,  the  percent  of  cells  with  condensates  was  found  to  increase  along  the  same  hierarchy.  Using  an  RNA  hairpin-specific  ligand,  I  was  able  to  observe  mRNA  co-localizing  with  GFP  at  the  poles  of  cells  that  form  condensates,  while  DNA  was  excluded  and  relegated  to  the  midcell.  Using  Fluorescent  Recovery  After  Photobleaching  (FRAP)  on  cells  with  condensates,  it  was  revealed  that  arginine-based  condensates  have  a  much  slower  recovery  rate,  and  a  smaller  fraction  of  mobile  protein,  showing  that  protein  mobility  within  the  dense  phase  is  lowered  in  arginine-based  condensates.When  expanding  the  scope  from  engineered  condensates  to  endogenously  phase  separating  proteins,  I  once  again  found  that  arginine  promotes  increased  condensate  formation  relative  to  lysine.  I  also  provide  preliminary  evidence  that  of  the  three  aromatic  amino  acids  (phenylalanine,  tryptophan,  and  tyrosine),  tryptophan  promotes  condensate  formation  in  biological  systems  at  a  higher  rate  than  the  other  two  amino  acids,  and  results  in  an  overall  reduction  in  protein  mobility  in  the  dense  phase.In  this  dissertation,  I  provide  evidence  for  rules  to  further  understand  the  chemical  grammar  of  BMC  formation.  These  studies  lay  the  foundation  for  the  prediction  of  protein  likely  to  engage  with  BMCs,  and  also  provides  crucial  information  for  the  design  of  synthetic  membraneless  organelles.
■590    ▼aSchool  code:  0054.
■650  4▼aBiophysics
■650  4▼aChemical  engineering
■650  4▼aPhysiology
■650  4▼aCellular  biology
■653    ▼aLiquid-liquid  phase  separation
■653    ▼aMembraneless  organelles
■653    ▼aPrimary  sequence
■653    ▼aBiomolecular  condensates
■690    ▼a0786
■690    ▼a0542
■690    ▼a0719
■690    ▼a0379
■71020▼aColumbia  University▼bCellular  Physiology  and  Biophysics.
■7730  ▼tDissertations  Abstracts  International▼g87-04B.
■790    ▼a0054
■791    ▼aPh.D.
■792    ▼a2025
■793    ▼aEnglish
■85640▼uhttp://www.riss.kr/pdu/ddodLink.do?id=T17359699▼nKERIS▼z이  자료의  원문은  한국교육학술정보원에서  제공합니다.

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