MARC

 008260126s2025        us                              c    eng  d
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■020    ▼a9798315799566
■035    ▼a(MiAaPQ)AAI31933616
■040    ▼aMiAaPQ▼cMiAaPQ
■0820  ▼a620.11
■1001  ▼aSharpe,  Christopher  A.  L.▼0(orcid)0000-0003-0519-7781
■24510▼aUnraveling  the  Web  of  Challenges  Around  Understanding  How  Black  Widow  Spiders  Spin  Silk
■260    ▼a[Sl]▼bNorthwestern  University▼c2025
■260  1▼aAnn  Arbor▼bProQuest  Dissertations  &  Theses▼c2025
■300    ▼a228  p
■500    ▼aSource:  Dissertations  Abstracts  International,  Volume:  86-12,  Section:  B.
■500    ▼aIncludes  supplementary  digital  materials.
■500    ▼aAdvisor:  Gianneschi,  Nathan  C.
■5021  ▼aThesis  (Ph.D.)--Northwestern  University,  2025.
■520    ▼aProducing  synthetic  spider  silks  has  been  a  Holy  Grail  of  materials  science  for  centuries,  but  only  relatively  recently  have  we  started  to  make  significant  progress  towards  that  goal.  Only  in  the  last  few  decades  have  we  discovered  the  ingredients  to  the  spider  silk  recipe  -  the  protein  composition,  sequences,  and  concentration  -  and  the  general  steps  that  occur  during  spinning:  changes  in  pH,  ion  exchange,  dehydration,  and  shear.  However,  we  still  lack  a  good  understanding  of  what  these  processing  steps  do  to  the  silk  proteins  themselves  and  how  they  give  rise  to  the  final,  complex  fiber.  Such  an  understanding  is  critical  to  transferring  the  in  vivo  system  into  an  industrial  process  capable  of  producing  large  quantities  of  high  performance  silk,  especially  since  the  synthesis  process  for  synthetic  vs  natural  silks  is  so  different.  Special  techniques  need  to  be  employed  to  "peak  under  the  hood"  and  see  how  the  silk  proteins  evolve  during  the  spinning  process.  Due  to  native  silk's  high  concentration  and  extreme  sensitivity  to  multiple  stimuli,  only  a  handful  of  techniques  can  be  used  to  probe  its  structure.  In  this  dissertation,  two  techniques  have  been  employed:  1)  traditional  Cryogenic  Transmission  Electron  Microscopy  (Cryo-TEM),  and  2)  High  Pressure  Freezing  -  Freeze  Substitution  (HPF-FS)  ultrastructure  electron  microscopy.  Cryo-TEM  uses  very  dilute  concentrations  of  sample,  which  must  be  prepared  carefully  to  minimize  shear  and  chemical  effects;  however,  this  dilute  state  is  much  closer  to  its  true,  hydrated  state  than  most  other  techniques  permit.  HPF-FS  allows  for  direct  imaging  of  the  in  vivo  tissue  and  observation  of  the  native  structural  thanks  to  flash-freezing  the  entire  silk  gland  at  high  pressure  to  preserve  native  structures  and  prevent  many  artifact-forming  processes,  followed  by  fixing  and  staining  at  cryogenic  temperatures  in  organic  solvent.  This  process  prevents  many  of  the  artifacts  found  in  chemical  fixation,  as  the  cryogenic  temperatures  of  freeze  substitution  minimize  many  osmotic  effects.  This  is  key  for  preserving  the  silk,  as  pH  and  dehydration  effects  are  known  stimuli in  its  spinning  process.  HPF-FS  also  incorporates  metal  stains  for  EM  contrast  and  concludes  with  embedding  the  sample  into  epoxy  resin,  protecting  it  from  most  shear  effects  as  well.  By  avoiding  stimuli  that  trigger  the  silk  protein  assembly  process,  HPF-FS  preserves  the  native  silk  gland  structures.  The  epoxy-embedded  sample  "chits"  are  then  sectioned  with  a  diamond  knife  and  imaged  by  SEM  or  TEM.However,  HPF  is  normally  constrained  to  samples  less  than  200  μm  thick,  while  the  silk  glands  are  400+  μm  thick  -  introducing  a  potentially  fatal  problem.  For  samples  thicker  than  200  μm,  the  high  pressure  is  almost  universally  insufficient  to  prevent  the  formation  of  large,  tissue-damaging  ice  crystals  that  alter  the  native  structure.  To  characterize  ice  crystallite  size,  I  employed  Cryogenic  Wide  Angle  X-ray  Scattering  (Cryo-WAXS)  for  the  post-HPF  pre-FS  silk  glands.  This  showed  that  most  HPF  samples  had  ice  crystallites  smaller  than  previously-characterized  silk  micelles  -  clearing  the  way  for  ultrastructure  characterization,  but  raising  questions  as  to  why  the  silk  glands  were  able  to  undergo  HPF  so  well.  To  date,  only  cryoprotectant-infiltrated  or  inherently  cryoprotective  thick  samples  have  been  able  to  go  through  HPF  without  significant  ice  damage.  We  tested  the  Ice  Recrystallization  Inhibition  (IRI)  activity  of  black  widow  dragline  silk,  and  found  it  to  have  an  IRI  IC50 of  0.14±0.03  mg/mL.  Compared  to  the  native  silk  concentration  of  ~400  mg/mL,  this  essentially  ensures  that  the  silk  itself  confers  the  cryoprotective  effect  enabling  successful  HPF.  However,  whether  that  activity  is  due  to  particular  proteins  in  the  dragline  silk,  particular  conformations  they  exhibit  prior  to  spinning,  or  another  factor  still  needs  to  be  explored.Finally,  I  describe  a  workflow  for  how  to  reconstruct  the  entirety  of  a  silk  gland  at  nanoscale  resolution.  This  reconstruction  process,  while  not  complete,  hopefully  will  serve  as  a  guide  to  others  undertaking  tissue  reconstruction  projects  of  this  scale.
■590    ▼aSchool  code:  0163.
■650  4▼aMaterials  science
■650  4▼aBiochemistry
■650  4▼aEntomology
■650  4▼aNanoscience
■653    ▼aBlack  widow
■653    ▼aCryo-TEM
■653    ▼aCryo-WAXS
■653    ▼aCryoprotectant
■653    ▼aSpider  silk
■653    ▼aUltrastructure
■690    ▼a0794
■690    ▼a0565
■690    ▼a0487
■690    ▼a0353
■71020▼aNorthwestern  University▼bMaterials  Science  and  Engineering.
■7730  ▼tDissertations  Abstracts  International▼g86-12B.
■790    ▼a0163
■791    ▼aPh.D.
■792    ▼a2025
■793    ▼aEnglish
■85640▼uhttp://www.riss.kr/pdu/ddodLink.do?id=T17356904▼nKERIS▼z이  자료의  원문은  한국교육학술정보원에서  제공합니다.

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